Selective and Wash‐Resistant Fluorescent Dihydrocodeinone Derivatives Allow Single‐Molecule Imaging of μ‐Opioid Receptor Dimerization

μ‐Opioid receptors (μ‐ORs) play a critical role in the modulation of pain and mediate the effects of the most powerful analgesic drugs. Despite extensive efforts, it remains insufficiently understood how μ‐ORs produce specific effects in living cells. We developed new fluorescent ligands based on the μ‐OR antagonist E‐p‐nitrocinnamoylamino‐dihydrocodeinone (CACO), that display high affinity, long residence time and pronounced selectivity. Using these ligands, we achieved single‐molecule imaging of μ‐ORs on the surface of living cells at physiological expression levels. Our results reveal a high heterogeneity in the diffusion of μ‐ORs, with a relevant immobile fraction. Using a pair of fluorescent ligands of different color, we provide evidence that μ‐ORs interact with each other to form short‐lived homodimers on the plasma membrane. This approach provides a new strategy to investigate μ‐OR pharmacology at single‐molecule level

How Detergent Impacts Membrane Proteins: Atomic-Level Views of Mitochondrial Carriers in Dodecylphosphocholine.

Characterizing the structure of membrane proteins (MPs) generally requires extraction from their native environment, most commonly with detergents. Yet, the physicochemical properties of detergent micelles and lipid bilayers differ markedly and could alter the structural organization of MPs, albeit without general rules. Dodecylphosphocholine (DPC) is the most widely used detergent for MP structure determination by NMR, but the physiological relevance of several prominent structures has been questioned, though indirectly, by other biophysical techniques, e.g., functional/thermostability assay (TSA) and molecular dynamics (MD) simulations. Here, we resolve unambiguously this controversy by probing the functional relevance of three different mitochondrial carriers (MCs) in DPC at the atomic level, using an exhaustive set of solution-NMR experiments, complemented by functional/TSA and MD data. Our results provide atomic-level insight into the structure, substrate interaction and dynamics of the detergent-membrane protein complexes and demonstrates cogently that, while high-resolution NMR signals can be obtained for MCs in DPC, they systematically correspond to nonfunctional states

Protonation spécifique des méthyles : un outil pour l'étude structurale des assemblages moléculaires par Résonance Magnétique Nucléaires

Standard NMR methods applied to the structural analysis of proteins are based on the measurement of local geometric information between protons. The lack of long range restraints can be limiting factor for the study of the modular proteins, protein complexes and supramolecular assemblies. Perdeuteration of samples is necessary for the study of these large systems. However, the exchange of protons with deuterium limit the number of detectable structural restraints, particularly NOEs distance restraints. To resolve this problem, a strategy based on the protonation of some discrete sites was developed. The specific protonation of methyls in proteins constitutes an optimum choice for detection of long range restraints. Protocols for specific labelling of methyls of Isoleucines, Valines and Leucines were implemented and optimized, and a new method for specific protonation of Alanines was introduced. In moderate size systems, the use of this specific labelling strategy combined with the development of NMR experiments allows the detection of restraints (NOEs and RDCs) between methyls separated by more than 12 Å. A robust method was developed to extract distances with very high precision. This approach can also be applied to large proteins. NOEs have been observed between methyls separated by more than 7 Å in a 468 kDa supramolecular assembly.Les méthodes RMN standard appliquées à l'analyse structurale des protéines sont basées sur la mesure d'informations géométriques locales entre protons. Le manque de contraintes à longue portée est un facteur limitant pour l'étude des protéines modulaires, des complexes protéiques et des assemblages supramoléculaires. La deutération des échantillons est nécessaire pour l'étude de ces systèmes de grande taille. Néanmoins, le remplacement des protons par du deutérium limite le nombre de contraintes structurales détectables, en particulier des contraintes de distances de types NOEs. Pour résoudre ce problème, une stratégie basée sur la protonation de quelques sites discrets a été mise en place. La protonation spécifique des méthyles dans des protéines constitue un choix optimal pour l'obtention de contraintes à longue portée. Les protocoles de marquage spécifique des méthyles des Isoleucines, des Valines et des Leucines ont été implémentés et optimisés, et une nouvelle méthode de protonation spécifique des Alanines a été développée. Dans des systèmes de taille modérée, l'utilisation de ce type de marquage combiné aux développements d'expériences RMN adaptées permet la détection de contraintes (NOEs et RDCs) entre paire de méthyles séparés par plus de 12 Å. Une méthode robuste a été développée pour extraire des distances avec une très haute précision. Cette approche s'applique également à des protéines de grande taille, ainsi des NOEs entre méthyles distants par plus de 7 Å sont détecté dans un assemblage supramoléculaire de 468 kDa

Protonation spécifique des méthyles : un outil pour l'étude structurale des assemblages moléculaires par Résonance Magnétique Nucléaires

Standard NMR methods applied to the structural analysis of proteins are based on the measurement of local geometric information between protons. The lack of long range restraints can be limiting factor for the study of the modular proteins, protein complexes and supramolecular assemblies. Perdeuteration of samples is necessary for the study of these large systems. However, the exchange of protons with deuterium limit the number of detectable structural restraints, particularly NOEs distance restraints. To resolve this problem, a strategy based on the protonation of some discrete sites was developed. The specific protonation of methyls in proteins constitutes an optimum choice for detection of long range restraints. Protocols for specific labelling of methyls of Isoleucines, Valines and Leucines were implemented and optimized, and a new method for specific protonation of Alanines was introduced. In moderate size systems, the use of this specific labelling strategy combined with the development of NMR experiments allows the detection of restraints (NOEs and RDCs) between methyls separated by more than 12 Å. A robust method was developed to extract distances with very high precision. This approach can also be applied to large proteins. NOEs have been observed between methyls separated by more than 7 Å in a 468 kDa supramolecular assembly.Les méthodes RMN standard appliquées à l'analyse structurale des protéines sont basées sur la mesure d'informations géométriques locales entre protons. Le manque de contraintes à longue portée est un facteur limitant pour l'étude des protéines modulaires, des complexes protéiques et des assemblages supramoléculaires. La deutération des échantillons est nécessaire pour l'étude de ces systèmes de grande taille. Néanmoins, le remplacement des protons par du deutérium limite le nombre de contraintes structurales détectables, en particulier des contraintes de distances de types NOEs. Pour résoudre ce problème, une stratégie basée sur la protonation de quelques sites discrets a été mise en place. La protonation spécifique des méthyles dans des protéines constitue un choix optimal pour l'obtention de contraintes à longue portée. Les protocoles de marquage spécifique des méthyles des Isoleucines, des Valines et des Leucines ont été implémentés et optimisés, et une nouvelle méthode de protonation spécifique des Alanines a été développée. Dans des systèmes de taille modérée, l'utilisation de ce type de marquage combiné aux développements d'expériences RMN adaptées permet la détection de contraintes (NOEs et RDCs) entre paire de méthyles séparés par plus de 12 Å. Une méthode robuste a été développée pour extraire des distances avec une très haute précision. Cette approche s'applique également à des protéines de grande taille, ainsi des NOEs entre méthyles distants par plus de 7 Å sont détecté dans un assemblage supramoléculaire de 468 kDa

Protonation specifique des methyles ( un outil pour l étude structurale des assemblages moléculaires par résonance magnétique nucléaire )

Les méthodes RMN standard appliquées à l'analyse structurale des protéines sont basées sur la mesure d'informations géométriques locales entre protons. Le manque de contraintes à longue portée est un facteur limitant pour l'étude des protéines modulaires, des complexes protéiques et des assemblages supramoléculaires. La deutération des échantillons est nécessaire pour l'étude de ces systèmes de grande taille. Néanmoins, le remplacement des protons par du deutérium limite le nombre de contraintes structurales détectables, en particulier des contraintes de distances de types NOEs. Pour résoudre ce problème, une stratégie basée sur la protonation de quelques sites discrets a été mise en place. La protonation spécifique des méthyles dans des protéines constitue un choix optimal pour l'obtention de contraintes à longue portée. Les protocoles de marquage spécifique des méthyles des Isoleucines, des Valines et des Leucines ont été implémentés et optimisés, et une nouvelle méthode de protonation spécifique des Alanines a été développée. Dans des systèmes de taille modérée, l'utilisation de ce type de marquage combiné aux développements d'expériences RMN adaptées permet la détection de contraintes (NOEs et ROCs) entre paire de méthyles séparés par plus de 12 A. Une méthode robuste a été développée pour extraire des distances avec une très haute précision. Cette approche s'applique également à des protéines de grande taille, ainsi des NOEs entre méthyles distants par plus de 7 A sont détecté dans un assemblage supramoléculaire de 468 kDa.Standard NMR methods applied to the structural analysis of proteins are based on the measurement of local geometric information between protons. The lack of long range restraints can be limiting factor for the study of the modular proteins, protein complexes and supramolecular assemblies. Perdeuteration of samples is necessary for the study of these large systems. However, the exchange of protons with deuterium limit the number of detectable structural restraints, particularly NOEs distance restraints. To resolve this problem, a strategy based on the protonation of sorne discrete sites was developed. The specific protonation of methyls in proteins constitutes an optimum choice for detection of long range restraints. Protocols for specific labelling of methyls of Isoleucines, Valines and Leucines were implemented and optimized, and a new method for specific protonation of Alanines was introduced. ln moderate size systems, the use of this specific labelling strategy combined with the development of NMR experiments allows the detection of restraints (NOEs and RDCs) between methyls separated by more than 12 Â. A robust method was developed to extract distances with very high precision. This approach can also be applied to large proteins. NOEs have been observed between methyls separated by more than 7 Â in a 468 kDa supramolecular assembly.GRENOBLE1-BU Sciences (384212103) / SudocSudocFranceF

1H, 13C and 15N backbone chemical shift assignments of camelid single-domain antibodies against active state µ-opioid receptor

International audienceNanobodies are single chain antibodies that have become a highly valuable and versatile tool for biomolecular and therapeutic research. One application field is the stabilization of active states of flexible proteins, among which G-protein coupled receptors (GPCRs) represent a very important class of membrane proteins. Here we present the backbone and side-chain assignment of the 1H, 13C and 15N resonances of Nb33 and Nb39, two nanobodies that recognize and stabilize the μ-opioid receptor (μOR) to opioids in its active agonist-bound conformation. In addition, we present a comparison of their secondary structures as derived from NMR chemical shifts

Methyl-specific isotopic labeling: a molecular tool box for solution NMR studies of large proteins.

International audienceNuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is a uniquely powerful tool for studying the structure, dynamics and interactions of biomolecules at atomic resolution. In the past 15 years, the development of new isotopic labeling strategies has opened the possibility of exploiting NMR spectroscopy in the study of supra-molecular complexes with molecular weights of up to 1 MDa. At the core of these isotopic labeling developments is the specific introduction of [1H,13C]-labeled methyl probes into perdeuterated proteins. Here, we describe the evolution of these approaches and discuss their impact on structural and biological studies. The relevant protocols are succinctly reviewed for single and combinatorial isotopic-labeling of methyl-containing residues, and examples of applications on challenging biological systems, including high molecular weight and membrane proteins, are presented

Sensitivity-optimized experiment for the measurement of residual dipolar couplings between amide protons

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